断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)是由猪圆环病毒2型(PCV2)引起的一种重要疾病，严重发病地区死淘率达40％以上。由于PCV2严重破坏猪的免疫系统，使各种疫苗免疫失败。因此，PCV2感染的早期诊断和病猪的淘汰成为PMWS防治的重点。有鉴于此，申请人提出了PMWS防控新策略：

(1)首先养殖户用PCV2 LAMP试剂盒定性检测猪群，将被PCV2感染的猪与健康猪隔离开来，防止交叉感染。

(2)用定量PCR试剂盒对被PCV2感染的猪进行定量检测，文献报道猪体内PCV2病毒超过4 000拷贝/mL血液就会患病，而患病猪很难康复，因此，建议将PCV2病毒超过4 000拷贝/mL血液的猪直接淘汰。

(3)母猪会将PCV2传播给仔猪，公猪会将PCV2传播给母猪，因此养殖户用PCV2 LAMP试剂盒定性检测种猪，将被PCV2感染的种猪直接淘汰。因此，通过以上两种方法组合起来进行检测、隔离和对病猪的适当淘汰可以防控PMWS，最大限度减少养殖户经济损失。

为此该团队建立了PCV2 LAMP现场可视化定性和荧光定量PCR快速检测支撑技术并成功开发出试剂盒。将两种试剂盒组合起来防控PMWS，最大限度减少养殖户经济损失。

目前PCV2检测方法的局限性

目前, PCV2 的诊断主要依靠免疫学检测技术和分子生物学检测技术。由于免疫学技术自身敏感性和特异性较差, 因此分子生物学检测技术得到了迅速的发展。

（1） PCR技术：易导致假阳性或假阴性结果出现；

（2） ELISA检测：每种基因产品都要开发和建立专门的检测试剂和方法，要建立所有基因产品的蛋白质检测法工作量很大；

（3）基因芯片：不仅需要昂贵的芯片制作系统，操作复杂、费时，对操作人员的专业素质要求比较高，容易造成样品污染。

技术介绍

针对上述问题， 该研究建立猪圆环病毒Ⅱ型的环介导等温扩增（LAMP）现场可视化快速检测方法以及TaqMan荧光定量PCR检测方法，将这两种检测技术组合起来防控PMWS

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)．

LAMP技术在核酸特异性扩增和检测领域已经显示出强大的威力，具有取代PCR扩增和检测的趋势，但该技术在畜牧兽医领域的应用研究较少。LAMP技术具有特异性强、灵敏度高、速度快、产物检测便捷、成本低等五个方面的优点。

实时荧光定量PCR技术

到目前为止是敏感性最高的核酸检测和定量技术。

技术路线

该团队的PCV2 LAMP 定性检测方法和PCV2荧光定量PCR定量检测方法与前人有许多不同：

（1）PCV2 LAMP现场可视化快速定性检测试剂盒:

a.设计的PCV2 LAMP引物序列未见报道；

b.增加了一对环引物，可使LAMP反应时间减少一半，这是前人工作所没有的；

c.在LAMP反应体系中添加了甜菜碱，加速了解链速度，这是前人工作所没有的；

d.减少了PCV2病毒核酸的提取步骤，首创了不提取PCV2病毒核酸，直接以猪血清样品为模板，直接加入反应体系进行LAMP反应，减少了操作的时间和步骤，降低了成本。

(2) PCV2荧光定量PCR定量检测试剂盒:

a.设计的荧光定量PCR引物和探针序列未见报道；

b.创造和优化了PCV2荧光定量PCR反应体系和参数，有效提高了PCV2荧光定量PCR反应效率，结果大大优于前人的报道；

（3）在世界上首次提出了将基于LAMP现场可视化快速定性检测方法和荧光定量PCR定量检测方法组合起来进行猪PCV2定性、定量现场快速可视化检测以防控PMWS的检测理论和技术。

检测灵敏度达到进出口农产品检测国际标准。无论在技术水平、还是试剂盒的灵敏度上均高于与国内外同类研究。

数据结果

（1）开发PCV2 LAMP现场可视化快速定性诊断试剂盒：

a.灵敏度：PCV2检测限：10拷贝/25ul反应液；b.特异性：与其它病毒DNA或cDNA无交叉反应；c.重复性：批内变异系数小于10%；批间变异系数小于20%；d.检测时间少于1小时；e.临床样品PCV2检出率70%；f.可进行可视化检测。

(2) 开发PCV2荧光定量PCR定量诊断试剂盒：

a.灵敏度：PCV2检测限：10拷贝/25ul反应液；PCV2定量限：100拷贝/25ul反应液；b.特异性：与其它病毒DNA或cDNA无交叉反应；c.重复性：批内变异系数小于10%；批间变异系数小于20%；d.临床样品PCV2检出率72%。

这两个试剂盒国内没有上市，属填补国内空白，成本每头份几元钱，售价几十元钱。全国每年存栏、出栏猪约10亿头。若有10%猪使用，将产生几十亿的销售额。

合作方式

两个试剂盒打包转让1500万元。本实验室配合受让方申报药证。

应用行业

畜牧兽医行业；生物制药厂、兽药厂、生物制品厂。

获奖认证

上海市科学技术奖证书